Estrutura do DNA

Os genes podem ser estudados a partir de três pontos diferentes: o molecular, o mendeliano e o populacional. Do ponto de vista molecular, o gene é a sequência e DNA que contém a informação necessária para sintetizar uma molécula de RNA. Cada gene está localizado em sum sítio do cromossomo.

A informação genética contida nas moléculas de DNA está localizada no núcleo da célula, e a síntese proteica ocorre no citoplasma conforme mostramos na imagem a seguir. Assim, o RNA mensageiro copia a informação presente no DNA e dirige-se até o citosol, no qual conduz a síntese da proteína. Dessa forma, no núcleo o DNA determina a sequência dos nucleotídeos do RNA mensageiro, e no citoplasma o RNA mensageiro estabelece a sequência de aminoácidos e proteínas.

Imagem 1.1 - Fluxo da informação genética em eucariotos

Fonte: Djalma Santos (2010).

O DNA é composto de monômeros chamados de nucleotídeos. Cada nucleotídeo é composto por uma base nitrogenada, um açúcar e um resíduo de ácido fosfórico ligados de maneira covalente. As bases nitrogenadas podem ser de dois tipos: pirimidinas e purinas. As pirimidinas são compostas pela citosina (C), timina (T) e uracila (U), com a presença de um anel aromático, e as purinas contêm adenina (A) e guanina (G), além de apresentarem dois anéis aromáticos.

O açúcar é uma pentose: a 2-desoxirribose que estabelece uma ligaçãoglicosídica entre o seu carbono C-1’ e o nitrogênio N-1 das pirimidinas ou o nitrogênio N-9 das purinas, portanto uma ligação N-glicosídica; e o ácidofosfórico se liga ao carbono C-5’ da pentose através de uma ligação éster. Assim, quando existe uma ligação apenas entre uma das bases nitrogenadas e a pentose, ligados de forma covalente, temos o nucleosídeo. Essa composição das bases é importante porque diferencia RNA e DNA em sua composiçãoquímica quanto a dois aspectos: o RNA possui ribose, no lugar da desoxirribose, e uracil, em vez de timina.

Imagem 1.2 - DNA com as bases e as ligações de pontes de hidrogênio

Fonte: Think Bio (2012).

Os ácidos nucleicos são produzidos a partir da polimerização de nucleotídeos. A ligação ocorre entre os monômeros a partir de duas ligações éster pelo ácido fosfórico com os grupos hidroxila dos carbonos C3’ e C5’ de nucleotídeos adjacentes, que é denominada ligação 3’, 5’- fosfodiéster. A partir disso é formado o esqueleto açúcar-fosfato ou hélice, o qual apresenta polaridade, com uma extremidade 5’ que possui o grupo fosfato, e a outra extremidade 3’ que apresenta a hidroxila livre. As bases nitrogenadas se posicionam em eixos perpendiculares ao esqueleto açúcar-fosfato. Assim, o fator primordial na estrutura dos ácidos nucleicos é a sequência de bases nitrogenadas.

A conformação que o DNA adota depende de vários fatores: nível de hidratação, sequência de DNA, direção e grau do superenrolamento, modificações químicas das bases, tipo e concentração de íons metálicos e presença de poliaminas em solução. Em condições fisiológicas, a maior parte do DNA de procariotos e eucariotos aparece com a forma desse modelo: uma hélice com giro para a direita (dextrógira) e entre 10 e 10,5 bases por giro, formando dois sulcos, um grande e profundo (sulco maior), outro pequeno, estreito ou raso (sulco menor). Essa estrutura pode transformar-se no A-DNA, forma rara já conhecida quando surgiu o modelo de Watson e Crick, também dextrógira, que existe somente em condições salinas altas ou de desidratação, contendo 11 pares de bases por giro e diferindo do B-DNA por uma rotação de 20° em relação ao eixo perpendicular da hélice, o que causa a mudança na aparência dos sulcos maior e menor.

Imagem 1.3 - Dupla hélice do DNA com o sulco maior e menor

Fonte: Canal Cecierj (2011).

Condensação do DNA

Podemos definir o termo “condensação do DNA” da seguinte maneira:

Nas células eucarióticas humanas, os núcleos têm em média 10 μ de diâmetro e abrange mais de metros de DNA empacotados em 46 cromossomos. Pela razão do genoma ocupar quase todo o espaço, uma célula precisa duplicar de maneira uniforme quase todo o DNA antes de se dividir. Para que essa tarefa ocorra é necessária a compactação da cromatina. O genoma humano é constituídos por aproximadamente 3,2 x 109 nucleotídeos que estão compactados e distribuídos nos 24 cromossomos (22 autossômicos e 2 sexuais).

Cada cromossomo é composto por uma única fita de DNA contínua ligada por meio de proteínas chamadas de histonas e não histonas, e esse complexo chamamos de cromatina. A unidade fundamental da cromatina é o nucleossomo que é composto de aproximadamente 146 pares de bases de DNA, enoveladas ao redor de octâmero central das proteínas histonas. Há cerca de cinco tipos de HISTONAS que são chamadas de H1, H2A, H2B, H3 e H4.

Imagem 1.4 - Organização de um nucleossomo formado por um octâmenro de histonas, associado à histona H1

Fonte: USP ([s. d.]).

O equilíbrio dinâmico da cromatina abrande diversos mecanismos entre os quais as modificações pós-traducionais das caudas N-terminal das histonas. Essas modificações podem resultar em transcrição ou silenciamento gênico através da acção de enzimas capazes de acetilar, desacetilar ou transferir grupamentos metil. Assim, uma alteração na expressão dessas enzimas pode levar à carcinogênese.

Centrômero

A região centromérica contém um núcleo central para a montagem do cinetócoro durante a divisão celular. Esse complexo vai garantir uma distribuição igual de cromossomos para as células-filhas. O DNA nessa região é formado por sequências altamente repetitivas, que originam uma constrição no cromossomo chamada de constrição primária. Nesse sítio, unem-se as cromátides-irmãs, sendo também o local onde ocorre a formação do cinetócoro.

O cinetócoro é uma estrutura única que liga os cromossomos ao fuso acromático, monitora essa ligação de cada cromossomo, através do checkpoint mitótico, e une as forças do fuso acromático e das proteínas para mover os cromossomos durante a pró-metáfase e a anáfase. O segmento cromossômico situado acima do centrômero é chamado de braço curto (p – do francês, petit), e abaixo do centrômero fica o braço longo (q). Assim, os cromossomos são classificados em três tipos, conforme a posição do centrômero: metacêntrico, quando o centrômero se localiza aproximadamente na região central e divide o cromossomo em dois braços de tamanhos similares; submetacêntrico, com o centrômero fora da região central e braços ligeiramente desiguais; acrocêntrico, com o centrômero próximo da extremidade e um braço curto muito pequeno.

Em metáfases de cromossomos humanos tratados com colchicina, o centrômero é visto nitidamente em todos os cromossomos. Durante a interfase, os centrômeros são vistos com coloração DAPI como estruturas brilhantes.

A constrição secundária é observado nos braços curtos dos cromossomos acrocêntricos. Em consequência desse estreitamento, sua extremidade apresenta-se visualmente separada do restante do cromossomo, sendo por isso denominada satélite (porção de cromatina que se localiza distal à constrição secundária dos acrocêntricos humanos).

Telômeros

O nome telômero vem do grego e significa “parte final”. As extremidades dos cromossomos possuem uma sequência de DNA (TTAGGG) repetida muitas vezes; e essas repetições, em grande parte, servem como locais para vinculação de proteínas específicas dos telômeros que impedem de obter o reparo das respostas normalmente ativadas por sequências de DNA terminais.

Assim, as funções biológicas dos telômeros são a proteção dos cromossomos e das fusões das sequências finais com outros cromossomos, reconhecimento dos danos do DNA, estabelecimento de mecanismos para a replicação do DNA, contribuem para a organização funcional do cromossomo no interior da célula, participa na regulação da expressão gênica e controla a capacidade replicativa das células humanas.

O tamanho dos telômeros é mantido por enzimas, chamadas de telomerases, que adicionam as repetições de seis nucleotídeos à sua extremidade. A enzima telomerase utiliza um componente interno, e também desempenha um papel importante, pois impede que as sequências teloméricas terminais se percam a cada divisão celular.

No entanto, essa enzima só́ está ativa nas células germinativas e embrionárias. Logo, à medida que se multiplicam, as células somáticas sofrem um encurtamento de suas extremidades, devido a uma falta de atividade da telomerase. Talvez esse encurtamento funcione como um sinalizador para os mecanismos de apoptose, indicando que a célula está envelhecendo e apresenta maior possibilidade de sofrer uma alteração estrutural.

Características dos cromossomos humanos

Os cromossomos estão localizados no núcleo. Os seres humanos possuem 46 cromossomos, divididos em 23 pares, sendo 44 autossomos e 2 sexuais. O estudo das características estruturais e numéricas dos cromossomos é feito a partir da citogenética. Essa técnica avalia defeitos relacionados com a estrutura cromossômica, bem como a quantidade de cromossomos. A observação de cromossomos é feita por um processo chamado cariotipagem, uma palavra derivada do grego karyon, que significa “núcleo”.

DNA repetitivo em tandem

O DNA repetitivo em tandem, ou DNA satélite, é uma forma intrigante e complexa de sequência de DNA que consiste em múltiplas cópias de nucleotídeos — os blocos construtores do DNA — dispostas em sequências repetitivas lado a lado ao longo dos cromossomos. Essas sequências podem variar em tamanho, desde apenas duas bases até vários milhares, e são classificadas com base em sua localização e no tamanho da unidade de repetição.

Tradicionalmente, o DNA repetitivo em tandem não foi considerado para codificar proteínas, sendo frequentemente referido como “DNA lixo”. No entanto, essa visão tem mudado ao longo dos anos com o crescente entendimento de que essas sequências desempenham funções importantes na estrutura cromossômica, regulação gênica e estabilidade do genoma. Por exemplo, as sequências de tandem localizadas nos telômeros e centrômeros são cruciais para a proteção dos cromossomos e para a segregação cromossômica correta durante a divisão celular.

As repetições em tandem (nas quais o início de uma repetição ocorre imediatamente adjacente ao final de outra) consistem em muitas repetições de sequências de DNA não codificadoras, que podem estar concentradas em locais restritos ou muito dispersas no genoma. Pode ser dividido em três subtipos:

1.DNA satélite: baseia-se nos segmentos de DNA relativamente simples, curtos e altamente repetitivos, que diferem do resto do DNA pelo arranjo das bases. Na época atual, o uso termo “satélite” foi ampliado para descrever o DNA altamente repetitivo, cujas sequências dispõem-se lado a lado (em tandem), mesmo que não possa ser separado do restante em decorrência de sua densidade nos gradientes. Essa característica pode ser aplicada na técnica de FISH (hibridização in situ por fluorescência), a qual é uma ferramenta para a citogenética molecular que utiliza sondas de DNA marcadas com fluorescência, com o objetivo de detectar anomalias cromossômicas como microdeleções e rearranjos complexos. As sondas utilizadas são sequências repetitivas (DNA satélite).

2.Minissatélites são formados a partir de duas famílias de repetições curtas em tandem. Podem ser do DNA telomérico, situado na porção terminal das extremidades cromossômicas (telômeros), consistindo em 10 a 15kb de repetições em tandem de uma sequência de DNA de 6 pb (TTAGGG). Esse DNA é necessário para a integridade cromossômica na replicação e é adicionado ao cromossomo por uma enzima específica denominada telomerase ou DNA minissatélite hipervariável, que ocorre nas proximidades dos telômeros e em outros locais dos cromossomos. O DNA hipervariável está localizado, principalmente, nas proximidades dos centrômeros e, como sua herança, responde às leis mendelianas. A medicina forense o utiliza quando precisa realizar estudos de paternidade ou de identidade de pessoas;

3.Microssatélites são repetições curtas em tandem (< de 10 nucleotídeos, geralmente 1 a 5 nucleotídeos), dispersas no genoma e com alto grau de polimorfismo. São conhecidas também como STRs (do inglês, short tandem repeats), utilizadas como marcadores moleculares na análise genômica.

DNA mitocondrial

O DNA mitocondrial (mtDNA) é um elemento genético extraordinário e distinto que desempenha um papel crucial na biologia celular e na herança. Enquanto a maior parte do DNA de um organismo está localizada no núcleo da célula e segue as regras mendelianas de herança, o mtDNA reside nas mitocôndrias, as “usinas de energia” da célula, e é herdado quase exclusivamente através da linha materna.

As mitocôndrias são organelas intracelulares, responsáveis pela produção de ATP, a molécula de energia que alimenta inúmeros processos celulares. Cada mitocôndria contém várias cópias de mtDNA, que são menores e estruturalmente distintas do DNA nuclear. Em humanos, o mtDNA é uma molécula de DNA circular de aproximadamente 16.569 pares de bases, contendo 37 genes. Estes genes são essenciais para a função normal da mitocôndria, incluindo a produção de proteínas importantes para a cadeia respiratória, responsável pela fosforilação oxidativa e geração de energia.

O DNA mitocondrial é uma molécula circular de fita dupla, com 16.569 pares de bases, existente no interior das mitocôndrias. A mitocôndria é formada por uma matriz limitada por duas membranas, uma externa e outra interna. Essa última apresenta dobramentos para dentro, formando cristas que aumentam internamente sua superfície total.

No genoma mitocondrial humano e de outros mamíferos apresenta 13 genes codificadores de proteínas, 22 genes de tRNA e 2 genes de rRNA. Os genes codificadores de proteínas encontram-se no complexo citocromo-c-oxidase (subunidades 1, 2 e 3) e nas regiões do citocromo b e das subunidades 6 e 8 do complexo da ATPase. Por meio de densidade, pode ser diferenciada uma fita simples leve (L) de uma pesada (H), na qual se encontra a maioria dos genes. Os genes mitocondriais utilizam um código genético diferente do usado pelos genes nucleares; em mamíferos, UGA para trp, AUA para met e AGA/AGG como códon de finalização.

Os bilhões de moléculas do DNAmt de qualquer indivíduo são geralmente idênticos e de herança materna, pois o espermatozoide contém escasso citoplasma, com poucas mitocôndrias; portanto, uma doença causada por mutação no DNAmt é herdada exclusivamente da mãe, como a oftalmoplegia externa progressiva crônica, a síndrome de Kearns-Sayre, a neuropatia óptica hereditária de Leber, a síndrome da epilepsia mioclônica com fibras vermelhas esgarçadas (EMFVE), a síndrome da encefalomiopatia mitocondrial, a acidose láctica e episódios parecidos com acidentes vasculares (EMALAV), entre outras.

A severidade de uma doença causada por uma mutação no DNA mitocondrial depende do tipo de mutação e da proporção entre as moléculas de DNAmt mutado e não mutado em um certo tipo celular. Por vezes, quando são detectadas mutações no DNA mitocondrial, as células podem conter uma mistura de moléculas de DNAmt selvagem ou mutado, caracterizando a condição chamada de heteroplasmia. Cada vez que uma célula de mamífero se divide, moléculas de DNAmt selvagens ou mutadas vão segregar ao acaso para as células filhas.

Assim, o genótipo em relação ao DNAmt pode se modificar entre uma divisão celular e outra, e entre uma geração e outra. O acaso pode fazer com que se estabeleçam linhagens predominantemente portadoras de DNA mutado ou predominantemente selvagens, uma vez que todas as enzimas necessárias para a replicação do DNA mitocondrial são codificadas pelo DNA nuclear; mutações no DNA mitocondrial, em teoria, não afetam sua capacidade de replicação. Ao contrário, foram descritos casos em que grandes deleções do DNA mitocondrial acarretaram vantagem replicativa.

Replicação do DNA

A replicação do DNA é um processo biológico fundamental que ocorre em todas as células vivas e é essencial para a propagação da vida. Este processo complexo é responsável pela cópia exata da informação genética de uma célula, garantindo que cada nova célula tenha um conjunto completo e idêntico de DNA.

Deste modo, a replicação do DNA é um processo que ocorre após o processo de divisão celular. Ela ocorre a partir da separação das duas fitas parenterais, com posterior produção de duas novas fitas, tendo as parentais como molde. Assim, cada nova molécula de DNA contém uma fita parental e uma fita recém-sintetizada, por isso a replicação do DNA é dita semiconservativa. Nesse processo estão envolvidas várias proteínas e enzimas que atuam no processo de forma ordenada garantindo fidelidade.

Imagem 1.5 - Replicação semiconservativa do DNA

Fonte: E-portfolio Biologia (2008).

As regiões de fita simples são feitas com a ajuda das proteínas de ligação de fita simples (SSB) que protegem essas regiões de sofrer hidrólise pelas nucleases. Para aliviar a tensão provocada pela torção da cadeia dupla durante o seu desenrolar pela helicase, a enzima DNA topoisomerase I se liga com a cadeia parental a montante da helicase. Essa enzima catalisa quebras transitórias das ligações fosfodiéster em um dos filamentos, fornecendo um eixo de rotação que permite que os segmentos de DNA em lados opostos da quebra girem independentemente, com o filamento intacto servindo como eixo. As topoisomerases I são bastantes eficazes, pois armazenam a energia resultante da clivagem das ligações fosfodiéster para serem reaproveitadas para recompor o filamento.

As DNA polimerases catalisam a adição de nucleotiídeos ao filamento em crescimento da extremidade 5’ para a 3’. No terminal 5’ do açúcar há um grupo fosfato e no 3’ existe uma hidroxila livre em que se estabelece a ligação fosfodiéster com o nucleotídeo que está sendo incorporado. As DNA polimerases, para realizarem o processo de polimerização, necessitam também dos quatro desoxirribonucleotídeos trifosfato (dTTP, dATP, dGTP e dCTP) e de Mg2+.

A DNA polimerase III é um complexo enzimático com 10 subunidades responsáveis pela polimerização 5’→3’ da fita de DNA recém-formada. Esta holoenzima apresenta, ainda, a atividade 3’→5’ exonucleásica que permite que nucleotídeos incorretos adicionados sejam prontamente removidos, um por vez, durante a replicação e substituídos por nucleotídeos corretos, mecanismo de revisão e reparo. A DNA polimerase I tem a função de reparar e remendar o DNA danificado e, para tanto, apresenta as atividades polimerásica 5’→3’ e exonucleásica 3’→5’ e 5’→3’, sendo essa última a que permite que vários nucleotídeos sejam removidos durante o reparo.

Durante o processo de replicação do DNA, uma das fitas novas é formada continuamente na direção 5’→3’ (fita líder), e a outra de maneira descontínua e no sentido inverso para manter a mesma direção 5’→3’ (fita retardatária). A fita descontínua é replicada através de fragmentos de Okasaki (1000 a 2000 nucleotídeos). Cada um desses fragmentos apresenta, além do DNA recém sintetizado, um RNA iniciador que será substituído por desoxirribonucleotídeos pela DNA polimerase I e a DNA ligase reconstituirá a nova fita. O filamento líder possui apenas um RNA iniciador que também será́ substituído pela DNA polimerase I.

A replicação do DNA é um processo semiconservativo, o que significa que cada uma das duas moléculas de DNA resultantes contém uma cadeia do DNA original e uma nova cadeia complementar. O processo começa com o desenrolamento da dupla hélice de DNA pelas helicases, seguido pela formação de uma bolha de replicação. A síntese do novo DNA é catalisada por enzimas chamadas DNA polimerases, que adicionam nucleotídeos complementares à cadeia de DNA moldadora, formando assim uma nova cadeia. Este processo envolve uma série de etapas reguladas cuidadosamente, garantindo a fidelidade e a precisão da replicação.

Na citogenética e no diagnóstico laboratorial, o entendimento da replicação do DNA é essencial, pois anomalias no processo podem levar a mutações genéticas e a uma variedade de distúrbios e doenças, incluindo câncer. Técnicas laboratoriais, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), aproveitam-se dos princípios da replicação do DNA para amplificar segmentos específicos de DNA, permitindo a detecção de mutações, a identificação de patógenos e a realização de testes genéticos.

Assim, a replicação do DNA não é apenas um pilar da biologia molecular e celular, mas também uma área crítica de estudo na medicina diagnóstica, tendo implicações diretas na compreensão de doenças genéticas e no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Estudando o ciclo celular

O ciclo celular é um processo ordenado e altamente regulado, que resulta na divisão de uma célula mãe em duas células filhas. É um pilar fundamental na biologia celular, governando o crescimento, a replicação e a morte celular. A importância do ciclo celular transcende a simples divisão; ele é essencial para o desenvolvimento embrionário, a renovação de tecidos e a reparação de feridas. A complexidade deste ciclo reflete os mecanismos evolutivos desenvolvidos para preservar a integridade do genoma e para regular a proliferação celular em resposta às necessidades do organismo.

A divisão celular ocorre a partir de uma sequência de eventos em que no crescimento da célula ocorre pela replicação de todos os seus componentes, com a posterior divisão em duas células-filhas.

O ciclo celular é composto por fases:

•Intérfase - nessa fase ocorre o crescimento da célula bem como o reparo para a próxima fase. Durante a interfase, a célula cresce, duplica seu DNA e se prepara para a mitose.

•Fase mitótica - também conhecida como a fase M, ocorre a separação dos cromossomos da célula mãe e a citocinese, na qual se dá o rompimento das membranas plasmáticas e a finalização do processo celular, dando origem a duas células-filhas.

Nessas fases são avaliados os erros nos processos que podem levar a célula ao processo de apoptose ou no desenvolvimento de células tumorais.

A célula passa a maior parte do tempo em intérfase, mas através de sinais químicos externos (hormônios e fatores de crescimento) ou internos (ciclinas e quinases – CDKs), a célula é sinalizada para entrar em divisão. Esses sinais que controlam o ciclo provêm de fora para dentro da célula, pois os fatores de crescimento liberados ligam-se aos receptores de membrana de células-alvo, os quais vão estimular a produção de sinalizadores intracelulares, ativando a cascata de fosforilação intracelular e induzindo a expressão de genes essenciais para o controle do ciclo celular (composto por CDKs e ciclinas, descritas em detalhe no capítulo de controle do ciclo celular).

O tempo médio para a divisão celular depende de fatores relacionados com a célula e com as condições fisiológicas como idade celular, disponibilidade de hormônios, fatores de crescimento, temperatura, pressão osmótica, pressão hidrostática e pressão do oxigênio externo e o ritmo circadiano.

A fase G1 é caracterizada pela intensa produção de síntese enzimática, é o momento em que a célula se engaja na maioria de suas funções fisiológicas normais. É um período de verificação e preparação: a célula monitora o ambiente para garantir que as condições sejam favoráveis e que ela tenha os recursos necessários para a replicação bem-sucedida do DNA (Cooper, 2000). A célula também verifica se o tamanho celular é adequado e se os mecanismos de reparo de DNA estão em plena operação, preparando-se assim para a próxima fase do ciclo celular.

A transição da fase G1 para a fase S é regulada por pontos de verificação do ciclo celular, que garantem que a célula está pronta para replicar seu DNA. Um desses pontos de verificação é o ponto de restrição em G1, um mecanismo crítico que decide se a célula deve entrar na fase S ou entrar em um estado de quiescência (G0) (Cooper, 2000). Durante este ponto de restrição, fatores como o tamanho da célula, a integridade do DNA e sinais externos são avaliados antes de prosseguir com a replicação do DNA.

Disfunções nos pontos de verificação de G1 podem levar à replicação de DNA danificado, o que pode resultar em mutações e contribuir para o desenvolvimento de doenças, como o câncer. Por isso, a fase G1 é um alvo frequente para estratégias terapêuticas que visam controlar a proliferação celular (Cooper, 2000).

A Fase S, ou fase de síntese, é um momento crucial no ciclo celular onde o DNA é replicado. Esta etapa é fundamental para garantir que cada célula filha receba uma cópia completa do genoma após a divisão celular. A replicação do DNA é um processo altamente sofisticado e regulado, que envolve uma série de enzimas e proteínas para assegurar a precisão e a integridade do DNA duplicado.

Durante a fase S, cada molécula de DNA é desenrolada e separada em duas fitas simples por enzimas chamadas helicases. Estas fitas servem de molde para a síntese de novas fitas complementares. As DNA polimerases, que são enzimas fundamentais neste processo, adicionam nucleotídeos complementares às fitas de DNA molde, formando assim as novas fitas de DNA. A replicação do DNA é iniciada em múltiplos pontos ao longo do genoma, conhecidos como origens de replicação, e progride bidirecionalmente, formando bolhas de replicação que se expandem até que todo o genoma seja duplicado (Alberts et al., 2015).

A precisão da replicação do DNA é vital para a manutenção da estabilidade genética. Erros durante este processo podem resultar em mutações, que, se não forem corrigidas, podem levar a distúrbios genéticos ou ao desenvolvimento de câncer. O processo de replicação conta com um sistema de revisão e correção, onde as DNA polimerases realizam uma leitura de prova (proofreading) e corrigem incorreções de pareamento de bases (Alberts et al., 2015). Além disso, a célula conta com outros mecanismos de reparo de DNA que atuam após a replicação para corrigir erros que passaram despercebidos pela DNA polimerase.

Os pontos de checagem do ciclo celular (checkpoints) atuam como reguladores da replicação do DNA, monitorando e respondendo a danos no DNA ou a erros de replicação. Caso seja detectado algum problema, estes pontos de checagem podem pausar a progressão do ciclo celular para permitir o reparo do DNA ou, em casos extremos, direcionar a célula para a apoptose, prevenindo a proliferação de células com DNA danificado.

Após a replicação do DNA na fase S, a célula entra na fase G2 do ciclo celular, um período de preparação intensa para a mitose, onde ocorre a divisão nuclear e citoplasmática. A fase G2 é marcada por uma série de eventos críticos que garantem que a célula esteja pronta para iniciar a mitose com o máximo de precisão.

Durante a fase G2, a célula sintetiza uma variedade de proteínas e outros componentes necessários para a divisão celular. Isso inclui a produção de tubulinas, que são os blocos construtores dos microtúbulos do fuso mitótico, uma estrutura essencial que ajuda a separar os cromossomos durante a mitose (Alberts et al., 2015). A célula também aumenta em tamanho, acumula energia e assegura a disponibilidade de recursos para serem divididos entre as células filhas.

Um aspecto crucial da fase G2 é a verificação da fidelidade da replicação do DNA. Os mecanismos de controle de qualidade, incluindo os pontos de checagem do ciclo celular, asseguram que o DNA foi replicado corretamente e que não há danos que possam levar a mutações genéticas. Se danos no DNA são detectados, o ciclo celular é temporariamente detido para permitir o reparo. Se o dano for irreparável, a célula pode ser direcionada para a apoptose para evitar a propagação de erros genéticos (Alberts et al., 2015).

A importância destes mecanismos de controle não pode ser subestimada, pois são eles que mantêm a integridade genômica e previnem a oncogênese. As células possuem um sistema de vigilância que inclui proteínas como p53, conhecida como o “guardião do genoma”, que desempenha um papel vital na prevenção do câncer ao garantir que apenas células com DNA intacto prossigam para a mitose (Alberts et al., 2015).

O deslocamento dos centrossomas ocorre através de dineínas e cinesinas. As cinesinas são motores proteicos que têm a capacidade de locomoção, usando os microtúbulos; e a dineína é uma proteína motora responsável pelos deslocamentos de organelas no citoplasma. Logo após a duplicação, os centrossomas começam a produção dos fusos astrais. Esses se juntam com as dineínas e promovem o deslocamento do centrossoma para os polos. Após isso, associam-se com as cinesinas para auxiliar no deslocamento. Quando o centrossoma já estiver em sua devida posição, o fuso astral se liga com cinesina, fazendo uma força contrária à tendência de movimento, fazendo com que o centrossoma pare em determinada posição). No estágio G0, a célula entra em um estágio de repouso e não entra em processo de divisão celular.

A fase M, ou mitose, é o processo pelo qual uma célula eucariótica divide seu núcleo e duplica seu conteúdo genético para gerar duas células filhas geneticamente idênticas. Esta fase é a culminação do ciclo celular e é essencial para a vida, pois permite o crescimento e a reparação de tecidos em organismos multicelulares, além de estar envolvida na reprodução assexuada de organismos unicelulares. A mitose é composta por cinco fases distintas: prófase, prometafase, metáfase, anáfase e telófase, cada uma caracterizada por eventos específicos e críticos para a divisão celular (Alberts et al., 2015):

•Prófase: durante a prófase, os cromossomos começam a condensar e se tornam visíveis sob um microscópio óptico. O nucléolo desaparece, e os centríolos (em células animais) começam a se mover para polos opostos da célula, iniciando a formação do fuso mitótico.

•Prometafase: na prometafase, a membrana nuclear se desintegra, permitindo que os microtúbulos do fuso se liguem aos cromossomos por meio de estruturas conhecidas como cinetócoros. Os cromossomos começam um movimento ativo em direção ao plano equatorial da célula, um processo orientado pelas forças do fuso mitótico.

•Metáfase: a metáfase é marcada pelo alinhamento dos cromossomos ao longo da placa metafásica, uma região imaginária equidistante dos polos da célula. Este alinhamento é crucial para garantir que cada célula filha receba uma cópia de cada cromossomo durante a divisão.

•Anáfase: durante a anáfase, as cromátides irmãs de cada cromossomo são separadas e puxadas para polos opostos da célula. Isso é conseguido através do encurtamento dos microtúbulos do fuso e da ação de proteínas motoras.

•Telófase: a telófase é a reversão da prófase e prometafase: os cromossomos descondensam, o nucléolo reaparece e duas novas membranas nucleares começam a se formar ao redor dos conjuntos de cromossomos nos polos da célula.

O significado da mitose é duplo: não só garante a distribuição equitativa do material genético para as células filhas, como também preserva a integridade e a quantidade de DNA através das gerações de células. Sem a mitose, não haveria mecanismo para o crescimento ordenado e a regeneração dos organismos, nem para a manutenção da diversidade e complexidade da vida.

A mitose é um processo finamente orquestrado e rigidamente controlado, com falhas potencialmente levando a aneuploidias – uma condição onde as células têm um número anormal de cromossomos, que pode resultar em doenças como o câncer.

Imagem 1.6 - Fases da mitose e meiose da célula

Fonte: Acervo da autoria (2023)

Na pesquisa, é utilizado a PHA (Fitohemaglutinina) é um mitógeno utilizado para estimular os linfócitos T para o cariótipo constitucional. A fitohemaglutinina (PHA) é derivada de extratos de sementes de Phaseolus vulgaris. Trata-se de uma glicoproteína que se liga às membranas das células e altera suas propriedades. A PHA altera a permeabilidade da membrana, levando a uma captação molecular aumentada que, em retorno, ativa a síntese macromolecular, levando a célula a entrar no ciclo celular.

A partir desse contexto, devemos também destacar a fase chamada de G0. A fase G0, ou quiescência, é uma etapa distinta do ciclo celular em que as células entram em um estado de inatividade ou saem do ciclo de divisão celular ativo. Esta fase é fundamental para o desenvolvimento, homeostase e resposta a danos no organismo.

Na fase G0, as células mantêm uma existência funcional, mas não avançam para a replicação do DNA ou para a divisão. Esta fase pode ser temporária ou permanente, dependendo do tipo de célula e das circunstâncias. Por exemplo, enquanto algumas células podem permanecer em G0 por um período prolongado e reentrar no ciclo celular em resposta a certos estímulos, outras, como os neurônios, entram em G0 de forma permanente após a diferenciação (Alberts et al., 2015).

A entrada na fase G0 pode ser desencadeada por uma variedade de sinais, incluindo a falta de nutrientes, a ausência de fatores de crescimento ou a presença de sinais supressores de crescimento. Além disso, a célula pode ser programada durante o desenvolvimento para entrar em G0 após um certo número de divisões celulares (Alberts et al., 2015).

Para sair da fase G0 e reentrar no ciclo celular, as células precisam ser estimuladas por sinais apropriados, como a reintrodução de nutrientes ou fatores de crescimento. Além disso, as células também podem ser estimuladas a sair de G0 como parte de um processo de reparo ou regeneração tecidual após dano ou lesão (Alberts et al., 2015).

Mecanismos de Controle do Ciclo Celular

Os checkpoints do ciclo celular são mecanismos de vigilância cruciais que mantêm a ordem e a integridade do processo de divisão celular. Eles atuam como sistemas de inspeção que podem desencadear a parada do ciclo, permitindo tempo para reparo de danos ou a conclusão de eventos essenciais antes de prosseguir para a próxima fase. Esses pontos de checagem estão posicionados em fases estratégicas do ciclo celular: G1, G2 e M.

Na fase G1, o ponto de checagem garante que a célula tenha alcançado o tamanho adequado e que o ambiente seja propício para a duplicação do DNA. Se o DNA estiver danificado, esse checkpoint também pode ativar vias de reparo ou, se o dano for irreparável, direcionar a célula para a apoptose.

Durante a fase G2, antes da mitose, um segundo ponto de checagem confirma se todo o DNA foi replicado corretamente e se está livre de danos. Esta verificação é essencial para prevenir a segregação anormal de cromossomos e a instabilidade genômica.

O checkpoint da mitose (M), também conhecido como checkpoint da placa metafásica, verifica se todos os cromossomos estão corretamente alinhados e presos ao fuso mitótico antes de permitir a transição para a anáfase. Isso assegura que a segregação cromossômica seja equitativa e evita que células com o número errado de cromossomos se formem, um estado conhecido como aneuploidia (Alberts et al., 2015).

A integridade desses checkpoints é vital para a prevenção de doenças. Em particular, falhas nos pontos de checagem do ciclo celular são frequentemente associadas ao desenvolvimento do câncer. As células cancerosas muitas vezes exibem alterações que permitem a elas evadir esses controles, levando à proliferação descontrolada (Alberts et al., 2015). Por exemplo, a proteína p53, que desempenha um papel crucial na ativação de respostas ao dano do DNA no checkpoint G1, é frequentemente encontrada mutada ou inativada em células cancerígenas.

A compreensão dos checkpoints do ciclo celular tem implicações diretas para estratégias terapêuticas, como a quimioterapia, que muitas vezes visa bloquear a progressão do ciclo em células cancerígenas, e para a identificação de biomarcadores que podem prever a resposta ao tratamento.

O ciclo celular é um processo altamente regulado que, quando perturbado, pode levar ao desenvolvimento de tumores ou câncer. A tumorigênese frequentemente decorre de falhas nos mecanismos de controle do ciclo celular, que normalmente garantem a precisão da divisão celular e a integridade do genoma. Essas falhas podem ser resultado de mutações genéticas que afetam proteínas reguladoras do ciclo, como ciclinas, quinases dependentes de ciclinas (CDKs), e supressores tumorais, como a proteína p53.

A progressão do ciclo celular é impulsionada pela ativação sequencial de complexos ciclina-CDK, que são inibidos por proteínas supressoras de tumores. Quando essas proteínas reguladoras são mutadas ou suas funções são comprometidas, células com DNA danificado podem continuar a dividir-se, acumulando mais mutações que podem levar à tumorigênese (Alberts et al., 2015). Por exemplo, uma mutação na proteína p53, que normalmente atua para reparar o DNA ou induzir a apoptose em células danificadas, pode permitir que células anormais evitem a morte celular e continuem a proliferar.

Dada a centralidade do ciclo celular no desenvolvimento do câncer, muitos alvos terapêuticos foram identificados nesse processo. Os inibidores de CDK, por exemplo, são uma classe de drogas anticancerígenas que podem interromper a proliferação de células cancerígenas ao impedir a progressão do ciclo celular (Alberts et al., 2015). Além disso, as drogas que mimetizam os danos ao DNA podem ativar checkpoints do ciclo celular e induzir a morte de células cancerígenas.

O estudo detalhado do ciclo celular e sua relação com o câncer é essencial para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que podem salvar vidas. A identificação de alvos moleculares dentro do ciclo celular não apenas ajuda no desenho de terapias mais eficazes, mas também permite uma abordagem personalizada do tratamento do câncer, potencialmente aumentando a eficácia e reduzindo os efeitos colaterais para os pacientes.

Explanação sobre os Inibidores de CDK (CKIs)

Os CKIs são uma família de proteínas que podem inibir a função das CDKs, prevenindo assim a transição para a próxima fase do ciclo celular até que todas as condições sejam adequadas. Eles agem se ligando às unidades de ciclina-CDK, alterando a conformação e inibindo a atividade enzimática das CDKs. Isso resulta na detenção temporária do ciclo celular, permitindo a reparação do DNA, a síntese de componentes adicionais necessários para a divisão celular ou a ativação de vias apoptóticas em caso de danos irreparáveis ao DNA.

Entre os CKIs mais estudados estão o p21^Cip1, p27^Kip1 e p57^Kip2. O p21 é um inibidor potente das CDKs e é regulado pelo supressor tumoral p53. Em resposta ao dano no DNA, p53 induz a expressão de p21, que então se liga aos complexos ciclina-CDK e bloqueia a progressão do ciclo celular, dando à célula tempo para reparar o DNA antes da replicação.

O p27^Kip1 é outro CKI que regula negativamente a transição da fase G1 para a fase S do ciclo celular, agindo como um supressor do crescimento celular. Sua expressão é induzida por sinais antiproliferativos e pode atuar como um tumor supressor em certos contextos.

O p57^Kip2 é estruturalmente semelhante ao p21 e ao p27 e desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário. Ele também tem a capacidade de inibir várias CDKs e está envolvido na indução e manutenção do estado de quiescência celular.

Checkpoints do Ciclo Celular

Os checkpoints do ciclo celular são mecanismos críticos de controle que monitoram e regulam a progressão do ciclo celular. Estes checkpoints asseguram que cada fase do ciclo celular seja completada corretamente antes de prosseguir para a próxima fase, garantindo assim a fidelidade da divisão celular e a prevenção de danos ao DNA que poderiam levar a mutações e câncer.

•O checkpoint de G1/S, conhecido como o ponto de restrição, é um dos mais importantes no controle do ciclo celular. Ele avalia a integridade do DNA antes de permitir a célula a entrar na fase S, onde o DNA será replicado. Se o DNA estiver danificado ou se as condições externas não forem favoráveis para a replicação do DNA, como a falta de nutrientes ou sinais de crescimento, o checkpoint de G1/S pode bloquear a progressão do ciclo para permitir a reparação do DNA ou para evitar a divisão celular em um ambiente desfavorável.

•O checkpoint de G2/M ocorre logo antes da entrada da célula na mitose. Este checkpoint garante que toda a replicação do DNA foi completada e que nenhum dano ao DNA ocorreu durante a fase S. Se for detectado algum dano, o ciclo celular é detido para que o reparo possa ocorrer. A proteína p53 desempenha um papel crucial neste checkpoint, podendo induzir a expressão de genes que reparam o DNA ou, se o dano for muito extenso, direcionar a célula para a apoptose.

•O checkpoint do spindle ou checkpoint da metáfase verifica se todos os cromossomos estão corretamente alinhados e ligados ao fuso mitótico antes da separação das cromátides irmãs durante a anáfase. Se um cromossomo não estiver corretamente alinhado, o checkpoint do spindle bloqueia a progressão da mitose para evitar a segregação desigual do material genético, o que poderia resultar em aneuploidia, uma característica comum de muitas células cancerosas.

Os checkpoints do ciclo celular e seus reguladores desempenham um papel crucial na manutenção da estabilidade genômica e na prevenção do desenvolvimento de câncer. A compreensão desses mecanismos é essencial para o desenvolvimento de terapias que visem especificamente as células cancerosas, tirando proveito de suas falhas nos mecanismos de checkpoint para induzir a morte dessas células.